Estudo in vitro de antibiótico

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Eu- lntrodução :

O objectivo de realizar um antibiograma é para prever a sensibilidade de um organismo a um ou mais antibióticos numa terapêutica essencialmente óptico. É também serve :

  • Em vigilância epidemiológica de resistência bacteriana ;
  • Na identificação bacteriana pela identificação da resistência natural.

Tenha em mente que, na prática, estudar o efeito dos antibióticos in vitro e normalmente sob condições de cultura convencionais. assim, ele deve ser determinada correlações para assumir a eficácia in vivo do antibiótico e, assim, para o sucesso (ou falha) tratamento na base de dados biológica em vitro.

II- Bactériostase :

1- definição :

Bacteriostasis corresponde a um abrandamento do crescimento de uma população bacteriana, -se à cessação do crescimento. Isto aplica-se apenas se as bactérias estava na fase de crescimento antes do contacto. Caso contrário, a falta de desenvolvimento pode também corresponder a um aumento acentuado na latência.

Bacteriostasis pode ser estudada no meio líquido, por exemplo, por monitorização fotométrica do crescimento de microrganismos na presença de várias concentrações de antibióticos.

2- MIC = Concentração Mínima Inibitória :

O parâmetro mais comumente usado para avaliar o efeito de um antibiótico é o IJC. Ele corresponde à concentração mínima de antibiótico que inibe o crescimento visível do organismo 24H. A CMI explora assim o efeito bacteriostático única, (nota que o seu uso não é justificado em um paciente imunodeprimido).

Nota boas correlações empregos biológico-clínicos IJC, que é um bom indicador da eficácia da terapia com antibiótico : Quando excede um certo valor tratamento falha é habitual : quando é inferior a outro sucesso valor é praticamente assegurada. Entre os dois valores anteriores, a previsão é impossível

3- determinação da CIM :

A IJC não é, para uma dada bactéria, constante biológica. É definida como a concentração mais baixa de uma gama de diluições de metade metade antibiótico que leva à inibição de qualquer crescimento bacteriano visível.

O método por diluição sucessiva em meio sólido é o método de referência para a susceptibilidade bacteriana aos antibióticos. Esta determinação requer rigorosa padronização de protocolo experimental (influenciar Nnoculum, incubação, a técnica de semeadura, antibióticos a ser testada, leitura, o meio de cultura e controles de qualidade), qualquer modificação das condições experimentais torna difícil interpretação.

Outros métodos são aplicáveis ​​sucessivas diluições em meio líquido (crescimento bacteriano avaliada pelo aparecimento de um distúrbio) ; E-Test (tiras impregnadas com um gradiente de antibiótico).

III- sensibilidade Concept / resistência :

1- Definição de resistência :

A resistência bacteriana aos antibióticos é quer naturais, é adquirido.

A resistência natural de uma espécie ou género é :

  • Uma característica, para todas as estirpes da espécie ou género
  • Transportada por um cromossomo sempre transmitida para a prole : transmissão vertical

Um carácter para definir o fenótipo selvagem ou sensíveis da espécie resistência adquirida, Por sua parte :

  • Preocupações apenas uma proporção mais ou menos grande, variável em vez
  • Resultante de uma modificação genética por mutação ou aquisição de plasmídeos ou transposões, (resistência cromossômica extra) horizontalmente transmissível, por vezes, entre espécies diferentes

Define fenótipos "resistente".

A resistência cruzada é expressa, eles, dentro da mesma classe de antibióticos e são, devido ao mesmo mecanismo de resistência.

2- Determinação da classe S / G / R :

os valores críticos foram determinados, que definem as categorias clínicos e proporcionar uma orientação para determinar a susceptibilidade das bactérias aos antibióticos. Os valores críticos definidos para as concentrações e os diâmetros das zonas de inibição, bem como as recomendações específicas para determinadas espécies ou grupos de antibióticos

Três categorias clínicos foram seleccionados para a interpretação de sensibilidade in vitro : sensato (S), resistente (R) e Intermediário (Eu).

As estirpes de S categorizados : são aquelas para as quais a probabilidade de sucesso terapêutico é forte, no caso de um tratamento sistémico com a dose recomendada

As estirpes R categorizados: são aqueles para os quais existe uma alta probabilidade de falha do tratamento, independentemente do tipo de tratamento e da dose de antibiótico usada.

Stem I categorizados : são aqueles em que o sucesso terapêutico é imprevisível. Estas estirpes são um conjunto heterogéneo para a qual os resultados obtidos in vitro não são preditivos de um sucesso terapêutico.

3- Estabelecimento de valores críticos que definem categorias clínicos :

O método de difusão por meio da relação entre a MIC e diâmetro de inibição em torno de uma fonte de antibiótico, leitura é relativamente simples. Para as bactérias e dado antibiótico, o diâmetro medido é a inibição em comparação com o diâmetro do fuso :

  • < o diâmetro crítico inferior, a estirpe é classificada R.
  • > u é maior diâmetro crítico do que D, a estirpe é S classificadas.

Críticos diâmetros e D correspondem, respectivamente, de alta e baixa crítica concentrações C c.

Os valores da concentração e diâmetros críticos são definidas para cada antibiótico

4- Relacionamento com o CM I :

Os olhos de concentrações e diâmetros críticos são considerados :

-► Sensitive (S) : estirpes para que a CIM do antibiótico testado ^ é a concentração crítica baixa (c), o qual é equivalente a um dietro > o diâmetro D crítico

-► resistente (R) : vis-à-vis o que tensiona a CIM do antibiótico testado, é > C elevada concentração crítica, correspondendo a um diâmetro < crítico diâmetro

-► De susceptibilidade intermediário (Eu) : vis-à-vis o que tensiona a CIM do antibiótico testado e o diâmetro correspondente estão entre as duas concentrações críticas e diâmetro de duas zonas.

categorias CMI (mg / L) diâmetro (milímetros)
sensato CMI ≤ c Diâmetro D ≥
resistente CMI > C diâmetro < d
Intermediair c < CMI ≤ C d ≤ Diâmetro < D

IV- Conceito de espectro :

À chaque antibiotique est associée une liste d’espèces bactériennes qui constitue le « spectre d’activité » de la molécule. espectro Natural, estabelecida em estudos iniciais antes de qualquer uso terapêutico, permanece estável por definição uma vez que não leva em conta a proporção de bactérias que tenham adquirido resistência aos antibióticos após uso. Esta proporção aumenta com o tempo, porque o uso dos antibióticos selectivos exerce pressão para o surgimento de mutantes ou estirpes que transportam factores de resistência extracromossómicos. Este conceito deve ser conhecida para o médico porque ele explica as situações aparentemente paradoxais : por exemplo, espectro natural de penicilina G compreende Staphylococcus aureus ao passo que actualmente 90% estirpes são resistentes ao produzir penicilinase.

V- Métodos para o estudo in vitro :

UMA- Antibiogramme :

1- Principe :

L & rsquo; testes de susceptibilidade é determinar a Concentração Inibitória Mínima (CMI) Uma estirpe bacteriana vis-à-vis vários antibióticos.

2- técnicas convencionais :

métodos de diluição

Os métodos de diluição são realizadas em meio líquido ou sólido no meio. Eles incluem colocar um inoculo bacteriano padronizado em contacto com concentrações crescentes de antibióticos em uma progressão geométrica de razão 2.

No meio líquido (figura 1), eu’inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (método de macrodiluição) ou cupules (método de microdiluição) contenant l’antibiótico. após incubação, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus faible concentration dantibiotique où aucune croissance nest visible.

Figura 1 : determinação da CIM por diluição em meio líquido.

Ex : A MIC da estirpe testada é 2 pg / mL (premier tube dans lequel aucune croissance nest visible à lœil nu).

Na forma sólida (figura Ibis), eu’antibiotique est incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Petri. A superfície do agar foi inoculado com um inoculo de estirpes para estudo. após incubação, la CMI de chaque souche est déterminée par linhibition de la croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d’antibiótico. O método de diluição de agar médio, levada a cabo com uma gama de concentrações em progressão geométrica, porque de 2 é o método de referência.

Figura 1bis : determinação da CIM por diluição em ágar.

Ex : A MIC da estirpe 3 vis-à-vis de lantibiotique incorporé à la gélose est de Ipg/mL. A MIC da estirpe 2 é 2 pg / mL. As determinações de MIC haste 1 e 4 exigir testes mais fortes concentrações crescentes de antibiótico.

métodos de entrega : padrão antibiogramme

Os métodos disponíveis ou susceptibilidade padrões são mais utilizados nos laboratórios de diagnóstico.

Discos de papel mata-borrão, antibióticos impregnados a ser testada, sont déposés à la surface dun milieu gélosé, previamente inoculado com uma cultura pura da estirpe a ser estudada. De’application des disques, antibióticos de difusão uniforme de modo a que as suas concentrações são inversamente proporcional à distância do disco. após incubação, les disques sentourent de zones dinhibition circulaires correspondant à une absence de culture. Quando a técnica é bem padronizados, les diamètres des zones dinhibition dépendent uniquement de la sensibilité du germe.

3- Estandardização :

A fiabilidade de resultados e rsquo; sensibilidade aos antibióticos é influenciada por vários parâmetros que devem ser estritamente controladas. A padronização é regida por documentos do’O.M.S. e as várias comissões nacionais. Dependendo do país, pode haver variações técnicas e é importante respeitar a mesma técnica usada para o’estabelecimento de curvas de concordância.

4- resultados :

leitura interpretativa do & rsquo; susceptibilidade

Leitura interpretativa do’antibiograma é baseado no conhecimento de fenótipos de resistência. Seu principal objetivo é transformar um resultado categorizado « sensato » em um resultado « intermediário » ou « resistente » en raison d’un risque déchec thérapeutique. A leitura requer interpretativa correcta identificação da estirpe e um método & rsquo; perfeitamente padronizado testes de susceptibilidade. La mise en évidence de phénoypes de résistance hautement improbables compte tenu de l’a identificação da cepa deve levar à verificação do’identificação bacteriana, à contrôler la pureté de l’inoculum et à contrôler la technique de l’antibiogramme.

agora, il existe des systèmes informatisés daide à la validation des résultats : sistemas especialistas que permitem a resultados anormais. Esta verificação de validação é :

  • Verificar a consistência germe / susceptibilidade
  • Detectando fenótipos de resistência impossíveis
  • Détecter l’ausência d’une résistance associée
  • Para reconhecer fenótipos anormais poderão corresponder a novos métodos de resistência.

rq : Généralisation des résultats à des antibiotiques non testés Le choix des antibiotiques testés repose avant tout sur lidentification du germe et sur la connaissance de sa résistance naturelle. Ce choix dépend également du site de l’infecção.

Parmi les antibiotiques susceptibles dêtre utilisés en thérapeutique, todas as moléculas não são tidos em conta. de fato, la connaissance des familles dantibiotiques et des mécanismes de résistance croisée permet de ne faire figurer dans lantibiogramme quun nombre restreint de molécules représentatives.

5- outros técnicos :

técnica agar : o E-Test®

A determinação precisa da CM pelo método de referência é de difícil utilização na prática diária. La commercialisation dune technique rapide et simple, o E-Test®(AB Biodisk) permite uma estimativa indirecta do laboratório CM (figura 4).

Figura 4 : o Etest®

B- Nos mesmos métodos :

1- Pesquisar betalactamases :

Inactivação dos enzimas de antibióticos beta-lactâmicos pode ser detectado por um método cromogénico :

Le principe repose sur l’uso de’une céphalosporine changeant de coloration après hydrolyse. O mais utilizado é a molécula que nitrocefina, après action dune bêta- lactamase, muda de amarelo para vermelho. Os discos impregnados nitrocefina papel são comercializados : teste Céfinase .

2- Pesquisar a resistência méticilino em estafilococos :

Dans les conditions standard de l’antibiogramme, apenas uma fracção da população expressa a resistência a penicilinas M. únicas condições mais drásticas (de incubação a 30 ° C ; hiper meio salgado MH) permitir uma melhor expressão de resistência. On dépose un disque doxacilline à la surface du milieu. A leitura é feita 24 48H, em seguida,. Uma resistência heterogénea que se manifesta pela presença de colónias de tamanho variável em torno do disco. A forte presença de MRSA no ambiente hospitalar faz a sua investigação essencial.

3- Pesquisar beta-lactamases à spectre étendu (explosões) :

A técnica também é usada para a divulgação dentro do espectro pesquisa beta-lactamase para Extended (explosões).

Pour cela on dispose sur la surface dune gélose des disques de ceftazidime (e / ou cefotaxima, e / ou cefepima, et/ou daztréonam) e D’amoxicilina-clavulânico (para Enterobacteriaceae) ou ticarcilina ácido clavulânico(pourle Pseudomonas aeruginosa)

Les BLSE sont des Bêtalactamases et sont donc inhibées par lacide clavulanique. On observe alors une synergie daction entre les deux antibiotiques, chamado « bouchon de champagne

Cette technique permet de différencier une bactérie hyper productrice de céphalosporinase dune bactérie produisant une BLSE dans la famille des Entérobactéries par exemple.

Vl- Caso especial do teste de susceptibilidade antimicrobiana automatizado :

eu’automatisation de lantibiogramme sest développée pour pallier aux inconvénients de cette technique manuelle, cuja realização é lento. agora, ce terme est utilisé pour désigner des appareils effectuant la lecture et linterprétation de tests faits manuellement. Estes dispositivos operam em 2 princípios :

  • Ils miment les tests conventionnels détude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques (A técnica mais comum : em meio líquido de diluição
  • Ou eles se comparam o crescimento de um testemunho ao observado na presença de um ou mais concentrações de antibióticos.

Os métodos de estudar o crescimento de bactérias empregar métodos ópticos directos :

  • A análise das imagens coletadas por uma câmera
  • Turbidimètrie (OD de uma suspensão proporcional à massa de partículas em suspensão) ;
  • nefelometria (medição da luz difractada). geralmente, nefelometria tem uma sensibilidade mais elevada, mas uma gama mais estreita de linearidade que turbidimetria.

VII- sinergia Eventos :

O uso de uma combinação de antibióticos é justificado em quatro casos :

-► Expandindo o espectro de actividade, no caso de várias infecções germinais ;

-► emergência Treat diagnosticada infecção grave ;

-► impedir a selecção de mutantes resistentes durante a longo prazo do tratamento ;

-► A obtenção de um efeito sinérgico.

A interacção dos dois antibióticos podem produzir efeitos quatro principais :

-► Indiferença : a actividade de um antibiótico não tem qualquer influência sobre a actividade da outra

-► Adição : o efeito da combinação é igual à soma dos efeitos produzidos por cada um dos antibióticos tomados separadamente

-► Synergy : o efeito da combinação é maior do que a soma dos efeitos produzidos por cada um dos antibióticos tomados separadamente : Ex beta-lactâmicos (ou vancomicina) facilitar a penetração de aminoglicósidos

-► antagonismo : o efeito da combinação é inferior à soma dos efeitos produzidos por cada um dos antibióticos tomados separadamente : ex bacteriostático (tetraciclinas, macrolídeos ou fenicóis) diminui a actividade bactericida de beta-lactama

VIII- Conclusão :

objectivos de susceptibilidade antimicrobiana para prever a sensibilidade de um organismo a um ou mais antibióticos, a fim de melhor adaptar a antibiótico num contexto infeccioso. Este estudo tem lugar in vitro e devem considerar outras características de antibióticos, Por exemplo farmacocinética, a fim de ter a oportunidade máxima de recuperação para o paciente.

técnicas de preparação do horário de verão evoluíram desde vinte anos com os avanços na automação. Isso ajudou a reduzir esperando vista a optimizar a qualidade do tempo cuidados, mas também para uma melhor susceptibilidade padronizar. contudo, técnicas antigas não desapareceram, porque as técnicas automatizadas não são perfeitos : bactérias anaeróbias e de crescimento lento crescimento deficiente sob técnicas em meios líquidos. Isto tende a provar que um laboratório de bacteriologia deve ter duas técnicas para executar DST : um automático e um manual, a fim de obter o máximo de complementaridade entre estas técnicas.

Cours du Dr RAMDANI Hakim – Faculdade de Constantino