الطرق’دراسة الخلية

0
12639

المقدمة :

الخلية هي ل’الوحدة الهيكلية والوظيفية الأساسية للكائنات الحية وبسبب صغر حجمها, بيولوجيا الخلية. كل’أولا, حاجة’الحصول على صورة مكبرة عالية الجودة ; هذا استلزم تطوير’أدوات مثل المجاهر والتقنيات المناسبة التي تم إتقانها بمرور الوقت.

وتنقسم المجهر إلى مجموعتين رئيسيتين, تختلف عن طبيعة الجسيمات الأولية المشاركة : المجهر الضوئي, كما دعا الضوئية, لأن’ويستخدم الفوتونات والمجهر الإلكتروني الذي يستخدم الإلكترونات لدراسة’بالموضوع.

لكي’مراقبة التفاصيل الدقيقة, يجب علينا زيادة دقة, والذي يتناسب بشكل عام مع الطول د’موجة من الإشعاع تستخدم للتداخل مع الهياكل المدروسة.

هناك نوعان رئيسيان من المجاهر من حلها : المجاهر الضوئية والصورة المجهر الإلكترونية.

المجاهر الضوئية :

المجاهر الضوئية (ضوء أو الضوئية) السماح لل’مراقبة الخلايا الحية أو الميتة, من خلال أقسام رقيقة جدا من الاستعدادات الثابتة, وبالتالي فإنه يعطي نظرة عامة على الخلايا أو الأنسجة ويسمح أيضا’فحص الخلية الحية.

المجاهر الضوئية تستخدم الضوء المرئي وحل السلطة من ضوء المجهر يصل الحد النظري ل 0.2 مساء, التكبير يجري أقصى X1000.

تعليق : وقد وضعت مثالا للالمجهر النقيض من المرحلة أثناء عرض الشرائح.

الشكل 3. مقارنة بين الصور التي تم الحصول عليها مع المجهر الضوئي العادي (على اليسار) مع وجود تباين المرحلة المجهري (على اليمين) المواد غير ملونة اصطناعيا : عرضية النبيبات الكلوية تخفيضات الثدييات.

المجاهر الإلكترونية :

– تستخدم المجاهر الإلكترونية أشعة’الإلكترونات المشحونة, يكون كتلة وتتصرف كموجة. وكلما زادت سرعة الإلكترونات كلما طالت الأطوال د’تنخفض الأمواج وكلما زادت الدقة. وقد تم تجهيز هذه المجاهر مع العدسات الكهرومغناطيسية. قوة حل المجهر الإلكترون 0,2 نانومتر، وغير 1 000 مرات أعلى من المجهر الضوئي, التكبير س يجري على الأكثر 100 000.

الشكل 1. الرسوم البيانية المقارنة بين مسارات أشعة الضوء والإلكترونات في المجهر الضوئي والمجهر الالكتروني.

تعليق : وقد وضعت مثالا للالمجهر الإلكتروني الماسح أثناء عرض الشرائح.

الملاحظة المجهرية للخلية :

مراقبة الخلية يحدث على مستويين ; الخارج والداخل.

INTERNAL الامتثال CELL :

أ- يقطع تقنيات إعداد :

ويرجع ذلك إلى انخفاض قوة اختراق الإلكترونات, الكائنات الملحوظة يجب أن يكون على ما يرام للغاية (تخفيضات 50 الى 80 نانومتر), الأمر الذي يتطلب عينات محددة أحدث التقنيات.

عندما المواد البيولوجية الصلبة (الأنسجة الحيوانية أو النباتية : كبد, دماغ, عضلة…, أو وقف, ورقة, راسين…), يجب عليك أولا تقطيعه إلى شرائح رقيقة ومنتظمة, والتي سوف ثم تكون ملونة. في زنزانة 20 مساء قطر, ويمكن توجيه الاتهام 200 الى 400 كشوفات ultrafines.

خطوات هذا يختلف بروتوكول لدرجة أن تتم مراقبة تحت المجهر الضوئي أو إلكترونية.

المجهر الضوئي المجهر الإلكتروني
تثبيت : أهداف لقتل الخلايا أثناء تغيير بأقل قدر ممكن الهياكل الداخلية. تستخدم لهذا الغرض خليط من مختلف, التي تحتوي على مواد معروفة لوالتخثر البروتينات أساسا : الأحماض, الكحول, الألدهيدات, بعض الأملاح… هذه المثبتون, التخثر قال, يجب أن تتكيف مع طبيعة المواد البيولوجية تحليلها ونوع من التلوين استخدامها لاحقا.
حرارة, كحول, الفورمالديهايد…. غلوتارالدهيد, حمض الاسموزي….
جفاف : يهدف إلى إزالة الماء من العينة والاستعاضة عنها المتوسطة المذيبات المستخدمة لإدراجها ; وتتكون من سلسلة من الحمامات في الكحول من زيادة تركيز. ويجب أن تكون هذه العملية تدريجيا بحيث الاستبدال لا يؤدي إلى تشوه أنسجة. يتم تنفيذ حمام النهائي في الكحول / خليط المذيبات العضوية من المتوسط ​​التضمين, للوصول في نهاية المطاف في العينة لديهم في هذا المذيب النقي : زيلين, التولوين…
إدراج أو طلاء : تهدف إلى تلقيح تماما الخلايا من مادة تصلب, السماح لخفض غرامة والعادية. هذه المادة, جزيئات تحل محل الواقع جزيئات الماء الأصلي, في كثير من الأحيان الشمع أو الراتنج الايبوكسي الذي هو السائل في 60 ° C ويستمر في درجة حرارة الغرفة ; قابل للذوبان في المذيبات المذكورة أعلاه, يخرقها بسهولة جدا في أنسجة. بعد عدة حمامات 60 ° C وعلاج الراتنج, نحصل على "كتلة" التي يمكن أن تخفض بشكل صحيح والذي يشغل أيضا منصب وسائط تخزين عينة.
البارافين الايبوكسي الاصطناعية
كوبيه : أهداف لإنتاج المقاطع رقيقة وشفافة من وجوه شملت. يستخدم مبضع للفحص المجهري للالمجهر الضوئي, المقدمة بشفرة الحلاقة المعدنية, إعطاء أقسام التسلسلية ; يتم لصقها بمحلول الجيلاتين على الشرائح الزجاجية, المجففة وdeparaffinized مع زيلين أو التولوين. فقط المواد العضوية من القسم المتبقي من شفرة.
– مشراح ذو شفرة معدنية من نوع Rassoir - من أجل 5 a7mm – شفرة زجاجية أو ماسية فائقة الصغر – من ترتيب 0.1 مساء وأقل
الإماهة : وهذا يتطلب استخدام سلسلة من تناقص الكحول العناوين, للوصول الى المياه.
تلوين : تمكن تلوين مناطق مختلفة بشكل مختلف من العينة البيولوجية.

  • لالمجهر الضوئي جميع الأصباغ المستخدمة هي أنهم تلوين العينة للذوبان في الماء وتسمح بمرور الضوء.
  • لالمجهر الإلكتروني هو أن المعادن الثقيلة التي تستخدم لتعزيز تباين منخفضة ناتجة عن تفاعل كبير بين الإلكترونات والسطوح البيولوجية.
الميثيلين الأزرق, الأحمر محايد… أملاح المعادن الثقيلة : سترات الرصاص…

 

الشكل 2. تخفيضات ملخص طريقة التحضير.

تقنيات المراقبة B-أشكال وسطوح الخلايا :

هناك عينات والأشياء ذات الأبعاد الصغيرة جدا, نموذج بسيط نسبيا (جزيئات, الفيروسات أو المكونات الخلوية معزولة : أوو دي أجهزة شظايا أجهزة) مع التفاصيل الدقيقة جدا التي لا تتطلب قطع معين في حالة الهياكل ليفية (protofilaments البروتين, سياط, بعض الفيروسات الذيل…). مراقبة هذه مجهر إلكتروني نافذ تشكل مشكلة عدم وجود تباين, نستطيع من خلالها معالجة باستخدام واحدة من هذه التقنيات اثنين :

1- لون سلبي : 2- METAL الظل :
برينسيبي : ولإيداع الكائن إلى أن تدرس على الدعم, ثم تزج التجميع في محلول ملحي من المعادن الثقيلة, الذي drainée.et أثر متبقي يركز الحل على زوايا أو حواف الأجسام. برينسيبي : ولإيداع الكائن إلى أن تدرس على الدعم, ثم تعريض تجميع الأبخرة المعدنية (الحصول عليها عن طريق تبخير في الخلاء القطب المعادن) وهذه زاوية السقوط لظل شكلت.
الشكل 4. مبدأ تلطيخ السلبية بعد تبخر المذيب التي تحتوي على "صبغة" وتراكم هذا الأخير حول الجزيئات أو الخلايا على الناقل الغشاء, واحد يحصل على تأثير الهالة مما يجعل من الممكن أن نرى هذه الجسيمات سلبية, المجهر الإلكتروني
الشكل 5. مبدأ التظليل المعدني بعد تبخر المذيب التي تحتوي على جزيئات أو خلايا في تعليق, وإيداعها على الناقل الغشاء. ويلي ذلك الجانب معدن رش الخلاء عملية ; هذا يؤدي إلى المعادن التي من شأنها خلق تأثير تراكم المترجمة من "الظل" في المجهر الإلكتروني.

عند مراقبة الأنسجة الضخمة, والمكونات الداخلية التي هي ليست نتيجة لخفض, ولكن من كسر, نتحدث عن كسر التجميد وcryodécapage.

3- Cryofracture وcryodécapage :

وتشكل هذه التقنية تطورا من تقنية تعرف الظل المعدني وضعت قبل عشر سنوات, أنه يستند في المقام الأول على تجميد السريع جدا من عينة بيولوجية صغيرة جدا (أقل من 1 مم 3), في النيتروجين السائل (- 196 ° C). الخطوة الحاسمة من البروتوكول هو الكسر, وليس التحول, العينة المجمدة, وهذا في درجات حرارة منخفضة للغاية. هذا التجميد كسر يظهر على سطح متفاوت من خلال عينة, وهو هذا المجال من شأنها أن يلاحظ.

ثم نفذ الحفر من سطح العينة التبخير, تحت فراغ ودرجات الحرارة المنخفضة, طبقة رقيقة من الجليد سطح ; ويكون من آثاره زيادة طفيفة في هياكل الإغاثة (cryodécapage).

يجعل مع التظليل المعدنية, الخلاء والبرد, لتعزيز النقوش). ثم يتم رش فيلم زي الكربون والغرامة على سطح معدني لتعزيز وتغطية المناطق غير المتضررة من المعدن. أدركنا حقيقية صب عالية الدقة لسطح كسر العينة : رد ; فمن تلك التي لوحظت في المجهر الإلكتروني النافذ. قبل مشاهدة, فلا بد لها أن تقلع من العينة عن طريق ذوبان الجليد, شطف وتسوية نهائية على المجهر شبكة الإلكترون .

الشكل 6 : مبدأ تشكيل صورة خلال كسر تجميد بروتوكول / cryodécapage (1) المثال جهازي proteoliposomes المدرجة في الجليد. (2) كسر الجليد الإفراج عن أي جزء مقعر (على اليسار), إما جزء محدب (على اليمين) الحويصلات. (3) جانب من النسخة المتماثلة المعدني الحصول على بعد التظليل أحادي الاتجاه (سهم) وتبخير الكربون. يظهر كسر الجانب العلوي أو بصمة من الجانب السفلي من البروتين الذاتية, وفقا لدرجة الدفن في طبقة ثنائية. النسخة المتماثلة المعدني للمنطقة الحالية و"جوفاء" أو "المطبات", حسب الحالات.
الشكل 7. الصور التي حصلت عليها تجميد كسر (ال) ظهور الجسيمات الشحمية التي تحتوي جزءا لا يتجزأ من طبقة ثنائية البروتين (proteoliposomes) وجود سطح خشن. (1ب) ظهور الجسيمات الشحمية سلسة مكونة فقط من الدهون. (2) ظهور غشاء بيولوجي (هنا غشاء هيولي من بويضة القيطم ; x75 000).

ملاحظات الخارجية THE CELL مقياس الالكترونية :

تقنية autoradioaraphie :

المقدمة :

العناصر المختلفة الموجودة في الطبيعة ليست السكان متجانسة من الذرات ; هي مزيج من نظائر (الكربون لها نفس عدد الإلكترونات ولكن كتلة مختلفة من النواة). جنبا إلى جنب مع معظم العناصر المشتركة : 1HJ 12C, الن, 160…, وتتميز النظائر النادرة مستقرة :2 H, 13C, 15ل ل, ال…, والنظائر المشعة : 3H, فيC… نوى التقرير الحالي الأخير بروتون / النيوترون غير متوازن, وتحدث جزيئات عفوية إعادة التوزيع بحيث يتم العثور على حالة مستقرة. ويرافق ذلك من خلال انبعاث الجسيمات المشحونة أو الإشعاع : نواة تفكك الحديث, هي ظاهرة النشاط الإشعاعي.

النشاط الإشعاعي من الذرات التي تشكل المادة الحية ويرجع ذلك أساسا إلى انبعاث إلكترونات سالبة (الجسيمات P-).

ويتميز كل النظائر المشعة من قبل ثلاثة المعلمات :

  1. نوع ناقل الحركة.
  2. فترة أو نصف الحياة, الوقت اللازم لنصف يضمحل ذرات.
  3. متوسط ​​الطاقة من الانبعاثات (وأعرب في ميجا إلكترون فولت, أو

MEV).

والنظائر المشعة الرئيسية المستخدمة في البيولوجيا أو علم وظائف الأعضاء الخلية هي : 3H – 14C – 32P – 35س « 22نا « 42ك – 125ل. وهي تستخدم في شكل جزيئات عضوية أو غير عضوية في أي واحد أو أكثر من الذرات المشعة ; لا تتميز كيميائيا من الآخرين عن طريق الخلايا ويتم استيعابها بشكل كامل (يمتص, تمثيله ودمجها في المواد الخاصة بها).

برينسيبي :

التصوير الشعاعي للسيارات يسمح لتحديد بدقة الأنواع الجزيئية المشعة في طائرة عينة. وتستند هذه الطريقة على مبدأ أن مركبات مشعة اعجاب المستحلبات الفوتوغرافية غير معلن (الشكل 8). الجسيمات (3 الصادرة عن 3H, ال 14C أو 32الحبوب بروميد P تقلل من الفضة الواردة في مستحلب لفضي لامع, طريقة ضوء. في حالة انقطاع, وهي مغلفة مستحلب مباشرة على عينة الالتزام على شريحة زجاجية.

بعد وقت التعرض متغير (بضع دقائق لبضعة أيام), اعتمادا على مقدار النشاط الإشعاعي وطبيعة النظائر المستخدمة, وكشف الفيلم الحساس ويعامل على أنه طبعة فوتوغرافية. على obseive, في مستحلب, تراكم الحبوب الفضية في الموقع الدقيق للانبعاثات الجسيمات (فوق عينة بيولوجية وصفت, إذا كان يقطع). في قرار عالية من تصوير الإشعاع الذاتي, للفحص المجهري

إلكتروني, تحدد التطور التقني على شكل حبيبات الفضة المتقدمة التي تتحقق النشاط الإشعاعي (منقط التقلبات الحبيبية أو شكل ; انظر الشكل 9).

الشكل 8. مبدأ صورة الإشعاع الذاتي

وهنا تطبيق التكنولوجيا لأقسام المعالجة لالمجهر الضوئي.

أدرجت الخلايا تحليلها, قبل العلاج, مقدمة DNA الإشعاعي محدد (الثيميدين tritiée), لذلك يبدو أن نوى فقط وضع علامة بعد تطوير مستحلب.

(1) صقها المسمى خلايا أكواب لشريحة زجاجية. (2) يلقي مستحلب التصوير الفوتوغرافي في الظلام.

(3) ظهور الخلايا يقطع بعد تطوير مستحلب.

(أ), (ب) و (ج) : ظهور الاستعدادات قطاعات 1, 2 و 3 ; (د) : قطاع المقربة (ج).

الشكل 9. تخطيط تصوير الإشعاع الذاتي الإلكترون المجهري يبين هذا القسم توليف الحمض النووي في اثنين من نوى الخلايا المنوية الأسماك. وحضنت الخلايا في وجود ثيميدين معالج بالتريتيوم ; والمترجمة "الحبوب" من المال لونين.

تقنية العزل الخلوية العضيات :

1- تجزئة الخلية والطرد المركزي التفاضلي :

وتتميز فئات مختلفة من العضيات التي حجمها, تشكيل و
كثافة; أشكال مختلفة من المعلمتين الأولى يمكن أن تكون كبيرة جدا (نوى متناول 10 ميكرون في القطر بينما تقيس الريبوسومات 15- 20 نانومتر) بينما تلك التي تتعلق كثافة منخفضة (من 1,1 حول لالميتوكوندريا, الجسيمات الحالة أو جسيم تأكسدي, الى 1,6 إلى الريبوسومات).

في حقل الجاذبية الأرضية, هذه العضيات أو الهياكل هي من تلقاء أنفسهم
معلقة في جناسة ويحصل أي فصل إلى أجزاء منفصلة.
إذا كنا مصطنع زيادة قيمة هذا الحقل بواسطة الطرد المركزي, هذه الجسيمات
الرواسب مع زيادة السرعة وفقا لخصائصها المختلفة
هيدرودينامي, بحيث جناسة يمكن مجزأة. نقطة النهاية الأولية
تحديد معدل الترسيب هو كتلة, ذلك أن معظم الجسيمات
أكبر وأكثر كثافة جناسة الرواسب تشكيل أول (أو بيليه) معا
في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي, السائل طاف تحتوي على أكثر أصغر و
ضوء. وelutriated وطاف بيليه.

الشكل 10. تجزئة خلية بروتوكول بواسطة الطرد المركزي التفاضلي وجناسة الأولي الحصول عليها من جزء الأنسجة (1 الى 3) مجزأة, بواسطة 4 الطرد المركزي القوي على نحو متزايد, سلسلة من 4 الرواسب التي تحتوي على عضيات أو الجزيئات كتلة أصبحت أضعف, وطاف â النهائي من التي لا شيء يمكن الرسوبية. وmicrosomes ل (قاعدة 3) هي حويصلات صغيرة ناتجة عن تجزئة بعض أنظمة الأغشية في الخلية خلال’التجانس.

2- أسلوب التدرج الكثافة التوازن :

والطاردات المركزية الفائقة وأجهزة متطورة جدا على اجهزة الطرد المركزي التقليدية ; يمكن الدوارات التي تتحول قرب 80 000 دورة في الدقيقة, وأنها توفر الجاذبية حقول يصل 500 000 الجاذبية الأوقات الأرض.

هذه التقنية استخدامات, في أنبوب الطرد المركزي, الاختلاف المستمر للتركيز مركب الذي الكثافة تتناقص بشكل منتظم من أسفل إلى أعلى. ويستند هذا الحل يشكل التدرج على السكروز (التدرج قبل المشكل), أو CSCL (التدرج autoformé) ; وعينة الاختبار, وتترسب على سطح السائل.

والمبدأ هو, أن يتم فصل جزيئات أو الأنواع الجزيئية على أساس الكثافة وحده. أثناء الطرد المركزي, هذه الرواسب’للوصول إلى مستوى التدرج حيث يكون للسائل كثافته بالضبط, وأنها تشكل الفرقة. هذا يتحقق, أنها لا تتحرك من هذا الموقف من التوازن, مهما كانت مدة الطرد المركزي (انظر الشكل 10). ويتم حصاد من ثقب أسفل الأنبوب واستعادة قطرة قطرة التدرج في سلسلة من الأنابيب.

هذه الأساليب من البروتين الطرد المركزي التحليلي أو الحمض النووي, تستخدم على نطاق واسع في السنوات 60-70, تم استغلالها لفصل جزيئات DNA. في الحل, لديهم كثافة والتي هي وظيفة من تكوينها

قواعد ; على الرغم من أن الاختلافات الملحوظة كثافة ضئيلة, أنها يمكن أن تكون متباينة من قبل التدرج CSCL. بعد الطرد المركزي من محلول الحمض النووي في CSCL, يتم الحصول على طول الأنبوب كما العصابات الكثير مستقرة كما أن هناك السكان متميزة من جزيئات الحمض النووي عن طريق كثافتها المزدهر, بغض النظر عن حجمها (التي لا تؤخذ بعين الاعتبار في الفصل). هذه التقنية, ويمكن أيضا DNA منفصل لها هي نتيجة لوجود النظائر الثقيلة الخلافات كثافة (DNA التي تحتوي على مثل 15N بدلا من 14N الطبيعي).

الشكل 11. الطرد المركزي التدرج الكثافة التوازن (autoformé التدرج CSCL) العينة (على العموم, الأحماض النووية) يذوب في البداية في حل CSCL الذي يحدد ما إذا كانت, أثناء الطرد المركزي, الانحدار المستمر من التركيز والكثافة. يتم فصل جزيئات إلى العصابات وفقا لكثافتها وحدها وتبقى في حالة توازن.

خلال DR AOUATI عامل – كلية قسنطينة