os métodos’estudo de células

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Introdução :

La cellule est lunité structurale et fonctionnelle fondamentales des organismes vivants et en raison de sa petite taille, biologia celular. tout d’primeiro, besoin den obtenir une image agrandie de bonne qualité ; ceci a nécessité la mise au point doutils comme les microscopes et de techniques appropriés qui ont été perfectionnés au fur et à mesure du temps.

Microscopia é dividido em dois grupos principais, diferente da natureza da partícula elementar envolvido : o microscópio óptico, também chamado fotônico, parce quil utilise des photons et le microscope électronique qui utilise des électrons pour étudier l’objeto.

Afin dobserver des détails encore plus fins, temos de aumentar a resolução, qui est généralement proportionnelle à la longueur donde de la radiation utilisés pour interférer avec les structures étudiées.

Existem dois tipos principais de microscópios de sua resolução : microscópios ópticos e electrónicos s microscópio.

microscópios ópticos :

microscópios ópticos (luz ou fotónica) permettent lobservation de cellules vivantes ou mortes, através de secções muito finas de preparações fixos, il donne ainsi une vue générale des cellules ou des tissus et permet aussi lexamen de cellules vivantes.

microscópios ópticos usar luz visível e o poder de resolução do microscópio de luz atinge o seu limite teórico para 0.2 PM, a ampliação estar x1000 máxima.

observação : Um exemplo da microscopia de contraste de fase foi desenvolvida durante o curso Slideshows.

Figura 3. Comparação de imagens obtidas com um microscópio de luz comum (esquerda) e com uma microscopia de contraste de fase (direito) Materiais corados artificialmente : transversal do túbulo renal cortes Mamífero.

microscópios eletrônicos :

Les microscopes électroniques utilisent des faisceaux délectrons qui sont chargés, têm massa e agir como uma onda. Plus les électrons sont accélérés plus les longueurs donde diminuent et plus la résolution augmente. Esses microscópios são equipados com lentes eletromagnéticas. O poder de resolução de um microscópio de electrões é 0,2 nm e é 1 000 vezes mais elevados do que para o microscópio óptico, ampliação x sendo, no máximo, 100 000.

Figura 1. Diagramas que comparam os caminhos dos raios de luz e os electrões num microscópio de luz e um microscópio de electrões.

observação : Um exemplo do microscópio eletrônico de varredura foi desenvolvido durante o curso Slideshows.

observação microscópica da célula :

A observação da célula ocorre em dois níveis ; fora e dentro.

INTERNO CONFORMIDADE COM CÉLULA :

UMA- corta técnicas de preparação :

Devido ao baixo consumo de energia de elétrons penetrar, os objetos observados tem que ser extremamente fina (cortes 50 para 80 nm), que requer amostras específicas tecnologia de corte.

Quando o material biológico é sólido (tecidos de origem animal ou vegetal : foie, cérebro, músculo…, ou tronco, folha, racine…), você deve primeiro cortá-lo em fatias finas e regulares, qual irá, em seguida, ser colorida. Numa célula 20 pm de diâmetro, pode cobrar 200 para 400 cupês ultrafinos.

Os passos deste protocolo diferente, na medida em que a observação é realizada sob microscopia óptica ou electrónica.

microscopia de luz microscopia eletrônica
Fixação : objetivos para matar as células ao mudar o mínimo possível as suas estruturas internas. Utilizado para este fim misturas diferentes, contendo substâncias conhecidas para desnaturar e coagular as proteínas essencialmente : ácidos, álcoois, aldeídos, certos sais… esses fixadores, disse coagulantes, deve ser adaptada à natureza do material biológico analisados ​​e tipo de corantes usados ​​mais tarde.
calor, álcool, formol…. glutaraldeído, ácido osmótica….
desidratação : destina-se a remover a água da amostra e substituí-lo por meio de um solvente utilizado para inclusão ; É constituída por uma série de banhos de álcoois de concentração crescente. Esta operação deve ser gradual para que a substituição não resulte numa deformação de tecidos. Um banho final é levada a cabo numa mistura de solvente álcool / orgânico do meio de incorporação, para finalmente chegar a amostra ter nesse solvente puro : xileno, tolueno…
Inclusão ou Coating : objetivos para impregnar totalmente as células de um material de endurecimento, permitindo um corte fino e regular,. esta substância, as moléculas realmente substituir as moléculas de água originais, frequentemente cera ou resina epóxi que é líquido à 60 ° C e à temperatura ambiente dura ; solúvel nos solventes acima mencionados, ele penetra muito facilmente para os tecidos. Depois de vários banhos 60 ° C e a cura da resina, obtemos um "bloco" que pode ser cortado corretamente e que também serve como meio de armazenamento da amostra.
parafina Epoxi sintético
Coupe : pretende produzir cortes finos e transparentes do objeto incluídos. micrótomo é usado para microscopia de luz, fornecida com uma lâmina de metal, dando cortes seriados ; celles-ci sont collées avec une solution de gélatine sur des lames de verre, secou-se e desparafinadas com xileno ou tolueno. Apenas o material orgânico da secção restante da lâmina.
Microtome à lame métallique de type Rassoir -de l’ordre de 5 a7mm Ultramicrotome à lame de verre ou de diamant – da ordem de 0.1 pm e menos
reidratação : Isso requer o uso de uma série de decrescentes títulos álcoois, para chegar à água.
Coloração : permite tingindo diferencialmente várias regiões da amostra biológica.

  • para microscopia de luz todos os corantes utilizados são eles estão colorindo a amostra solúveis em água e permitem a passagem da luz.
  • para microscopia electrónica é que os metais pesados ​​que são usados ​​para melhorar o contraste de baixa resultante de pouca interacção entre os electrões e as superfícies biológicas.
azul de metileno, vermelho neutro… sais de metais pesados : citrato de chumbo…

 

Figura 2. Resumo dos métodos de preparação cortes.

B-formas técnicas de observação e superfícies celulares :

Existem amostras e objectos com dimensões muito pequenas, forma relativamente simples (moléculas, Vírus ou componentes celulares isolados : OU d'órgãos fragmentos órgãos) com detalhe muito fino que não requer corte especial, no caso de estruturas fibrosas (protofilaments proteína, flagelos, alguns vírus cauda…). A observação destes transmissão de microscópio electrónico coloca um problema de falta de contraste, em que podemos resolver usando uma destas duas técnicas :

1- NEGATIVO COR : 2- METAL SOMBRA :
Principe : é para depositar o objecto a ser examinado num suporte, depois imergir o conjunto numa solução de sal de metal pesado, que é drainée.et traço restante focos solução sobre os cantos ou arestas de objectos. Principe : é para depositar o objecto a ser examinado num suporte, em seguida, expor o conjunto dos vapores metálicos (obtido por vaporização de um vácuo eléctrodo de metal) e este ângulo de incidência de uma sombra formada.
Figura 4. Princípio de coloração negativa Após a evaporação do solvente contendo o "corante" e acumulação deste último em torno das partículas ou células num suporte de membrana, obtém-se um efeito de halo tornando possível ver estas partículas negativo, microscopia eletrônica
Figura 5. Princípio de sombreamento metálico Após a evaporação do solvente que contém as partículas ou células em suspensão, eles são depositados num suporte de membrana. Isto é seguido por uma operação de vácuo de metal lado pulverização ; Isto leva a um metal que vai criar um efeito de acumulação localizada de "sombra" na microscopia electrónica.

Ao observar o tecido maciça, e seus componentes internos que não são o resultado de um corte, mas de fractura, falamos de fratura congelamento e cryodécapage.

3- Cryofracture e cryodécapage :

Esta técnica constitui um desenvolvimento da técnica conhecida sombra metálica desenvolvido dez anos antes, se baseia essencialmente no muito rápido congelamento de uma muito pequena amostra biológica (menos 1 milímetros 3), em azoto líquido (- 196 ° C). A etapa crucial do protocolo é a fractura, e não interrupção, a amostra congelada, e esta a temperaturas muito baixas. Esta congelação-fractura emerge uma superfície irregular através da amostra, e é nesta área que será observado.

Realiza-se então o condicionamento da superfície da amostra por sublimação, sob vácuo e a baixa temperatura, uma camada fina de gelo de superfície ; que tem o efeito de aumentar ligeiramente as estruturas em relevo (cryodécapage).

Faz com um sombreamento de metal, vácuo e frio, para fortalecer os relevos). Uma película de carbono e uniforme é então muito bem pulverizada sobre a superfície metalizada para reforçar e cobrir as áreas não afectadas pelo metal. Nós percebemos uma verdadeira moldagem de alta precisão da superfície de fratura da amostra : responder ; é aquele que é observado no microscópio electrónico de transmissão. antes de assistir, ele vai ter que tirar a partir da amostra por descongelamento, enxaguar e, finalmente, resolver sobre uma grade de microscopia eletrônica .

Figura 6 : Princípio da formação da imagem durante o congelamento fractura protocolo / cryodécapage (1) Exemplo dois proteolipossomas incluído em gelo. (2) gelo quebrado libertando tanto a porção côncava (esquerda), quer a porção convexa (direito) vesículas. (3) Aspecto da réplica metálico obtido após sombreamento unidireccional (seta) e vaporização de carbono. As mostras de fractura do lado superior ou do cunho do lado de baixo da proteína intrínseca, de acordo com seu grau de enterro na bicamada. A réplica de metal da presente área e os "ocos" ou "solavancos", como o caso.
Figura 7. As fotografias obtidas por congelação-fractura (o) Aparecimento de lipossomas contendo bicamada proteína incorporado (proteolipossomos) e que tem uma superfície áspera. (1b) Aparência lisa lipossomas compostos apenas de lípidos. (2) Aparecimento de uma membrana biológica (aqui a membrana citoplasmática de um oócito de Xenopus ; x75 000).

OBSERVAÇÕES EXTERNAS DO CELL balança eletrônica :

Técnica de autoradioaraphie :

Introdução :

Os diferentes elementos que se encontram na natureza não são populações homogéneas de átomos ; são misturas de isótopos (de carbono tendo o mesmo número de electrões, mas uma massa diferente de núcleo). Juntamente com os elementos mais comuns : 1HJ 12C, oN, 160…, isótopos estáveis ​​raras são distinguidos :2 H, 13C, 15l l, 1sO…, e radioisótopos : 3H, emC… Os núcleos do presente relatório um último protão / neutrões desequilibrada, e partículas redistribuição espontânea ocorrer de modo a que um estado de equilíbrio é encontrado. Esta é acompanhada pela emissão de partículas carregadas ou radiação : do kernel falar desintegração, é o fenómeno de radioactividade.

A radioatividade de átomos que constituem a matéria viva é principalmente devido à emissão de elétrons negativos (partículas P-).

Cada radioisótopo é caracterizada por três parâmetros :

  1. o tipo de transmissão.
  2. o período ou meia-vida, o tempo necessário para que metade dos átomos de decaimentos.
  3. a energia média da emissão (expressa em mega elétron-volts, ou

MEV).

Os principais radioisótopos utilizados em biologia ou fisiologia celular estão : 3H – 14C – 32P – 35S « 22Na « 42K – 125eu. Eles são utilizados sob a forma de moléculas inorgânicas ou orgânicas, em que um ou mais átomos são radioactivos ; eles não são quimicamente distinguidos dos outros pelas células e são inteiramente assimilado (absorvido, metabolizados e incorporados em material próprio).

Principe :

radiografia auto permite localizar com precisão um espécies moleculares radioactivas em plano de uma amostra. Este método baseia-se no princípio de que os compostos radioactivos imprimir emulsões fotográficas não expostas (figura 8). partículas (3 emitido pelo 3H, o 14C ou 32grãos de brometo de p reduzir a prata contida na emulsão para prata metálica, a forma de luz. No caso de cortes, a emulsão está directamente revestida na amostra aderido sobre a lâmina de vidro.

Depois de um tempo de exposição variável (de alguns minutos a alguns dias), dependendo da quantidade de radioactividade e a natureza do isótopo utilizado, a película sensível é revelado e tratado como um fotolito. em obseive, na emulsão, acúmulo de grãos de prata na localização precisa da emissão de partículas (acima da amostra biológica marcado, se corta). Em auto-radiografia de alta resolução, para microscopia

eletrônico, desenvolvimento técnico determina a forma de grãos de prata desenvolvidas que a radioatividade materializar (puntiformes torções forma granular ou ; veja a Figura 9).

Figura 8. Princípio da autoradiografia

A tecnologia está aqui aplicada a seções tratadas para microscopia de luz.

As células analisadas incorporaram, antes do tratamento, um precursor específico de ADN radioactivo (timidina tritiée), de modo que apenas os núcleos apareça marcado após o desenvolvimento da emulsão.

(1) copos de células marcadas colada a uma lamela de vidro. (2) A transmissão de uma emulsão fotográfica no escuro.

(3) Aspecto das células corta após o desenvolvimento da emulsão.

(uma), (b) e (c) : preparações seccionais aparência 1, 2 e 3 ; (d) : closeup setor (c).

Figura 9. Disposição autorradiografia de electrões microscopia Esta síntese de ADN na secção mostra dois núcleos de espermatócitos peixe. As células foram incubadas na presença de timidina tritiada ; o "grão" de dinheiro são localizados a cromatina.

Isolamento técnico DE CELULAR ORGANELAS :

1- fraccionamento celular e centrifugação diferencial :

As diferentes classes de organelos distinguem-se pelo seu tamanho, moldar e
densidade; as variações dos dois primeiros parâmetros podem ser muito grandes (alcance núcleos 10 microns de diâmetro, enquanto os ribossomas medir 15- 20 nm) enquanto que as relativas à densidade são baixos (de 1,1 sobre a mitocôndria, lisossomos ou peroxisomes, para 1,6 aos ribossomos).

No campo de gravidade da Terra, estes organelos ou estruturas são espontaneamente
suspensas no homogeneizado e fica sem separação em fracções separadas.
Se nós artificialmente aumentar o valor deste campo por centrifugação, estas partículas
sedimentos com maior velocidade e diferente de acordo com suas características
hidrodinâmica, de modo que o homogenato pode ser fraccionado. O endpoint primário
determinar a taxa de sedimentação é a massa, de modo que a maioria das partículas
maior e mais denso o homogeneizado sedimentos formam a primeira (ou pelete) juntos
na parte inferior do tubo de centrífuga, o líquido sobrenadante contendo o menor e mais
luz. O sobrenadante e o sedimento são elutriadas.

Figura 10. fraccionamento de células por centrifugação diferencial Protocolo O homogenato inicial obtido a partir de um fragmento de tecido (1 para 3) fraccionado, por 4 centrifugação cada vez mais forte, uma série de 4 sedimentos contendo organelos ou partículas da massa cada vez mais fraca, e um sobrenadante de uma final a partir do qual nada pode ser sedimentado. os microssomas (base 3) sont de petites vésicules provenant de la fragmentation de certains systèmes membranaires de la cellule au cours de lhomogénéisation.

2- A técnica de densidade de equilíbrio de gradiente :

Os ultracentrifugadoras são máquinas altamente sofisticados mais de centrífugas convencionais ; seus rotores pode transformar-se perto 80 000 rpm, e eles fornecem gravidade campos up 500 000 gravidade de tempos Terra.

Esta técnica utiliza, no tubo de centrífuga, uma variação contínua da concentração de um composto cuja densidade diminui regularmente de baixo para cima. A soluo que constitui o gradiente é baseado em sacarose (gradiente pré-formado), ou CsCl (gradiente autoformé) ; e a amostra de teste, é depositado sobre a superfície do líquido.

O princípio é, que as partículas ou espécies moleculares são separadas com base na densidade sozinho. durante a centrifugação, celles-ci se sédimentent jusquà atteindre le niveau du gradient où le liquide a exactement leur densité, e eles formam uma banda. este alcançado, eles não se movem a partir desta posição de equilíbrio, qualquer que seja a duração de centrifugação (veja a Figura 10). Dispositivo de colheita é feita por perfuração do fundo do tubo e recuperando gradiente gota a gota, de uma série de tubos.

Estes métodos de centrifugação analítica proteína ou ácido nucleico, amplamente utilizado nos anos 60-70, têm sido explorados para a separação de moléculas de ADN. em solução, eles têm uma densidade que é uma função da sua composição

bases ; embora as diferenças de densidade observados são pequenos, eles podem ser diferenciados por um gradiente de CsCl. Após centrifugação de uma solução de ADN em CsCl, são obtidos ao longo do tubo à medida que bandas muito estáveis ​​como existem populações distintas de moléculas de ADN pela sua densidade flutuante, independentemente do seu tamanho (que não tidos em conta na separação). esta técnica, pode também ADN separado tendo as diferenças de densidade são devidos à presença de isótopo pesado (ADN contendo, por exemplo, em vez de 15N a 14N normais).

Figura 11. A centrifugação de equilíbrio em gradiente de densidade (autoformé gradiente de CsCl) a amostra (geralmente, ácidos nucleicos) é inicialmente dissolvida na solução de CsCl em que se estabelece, durante a centrifugao, um gradiente contínuo de concentração e densidade. As moléculas são separados em bandas de acordo com a sua densidade sozinho e permanecem no estado de equilíbrio.

Curso do DR AOUATI Amel – Faculdade de Constantino